Conţinut
- etape
- Metoda 1 Identificați o bacterie prin colorația Gram
- Metoda 2 Efectuați testul de colorare Ziehl-Neelsen
- Metoda 3 Studiați comportamentul și aspectul bacteriilor
- Metoda 4 Interpretați toate rezultatele
Identificarea bacteriilor este o sarcină complexă. Unul dintre motive este că, conform estimărilor, există între 10 000 și 1 miliard de specii bacteriene în lume! Identificarea corectă a bacteriilor este foarte importantă, în special în domeniul medical, unde tratamentul adecvat al unei boli depinde în mare măsură de tipul de microb care cauzează problema. În cele mai multe cazuri, identificarea se face pe baza eliminării. Pentru a identifica o bacterie, trebuie să efectuați teste de colorare, să analizați aspectul acesteia și să observați cum reacționează bine la diferite condiții. Dacă aveți nevoie de un rezultat rapid, luați un eșantion de ADN pentru a-l trimite la un laborator.
etape
Metoda 1 Identificați o bacterie prin colorația Gram
- determina dacă bacteriile sunt Gram pozitive sau negative. Colorația Gram este o metodă de a împărți bacteriile între cele mai comune două tipuri: Gram pozitiv și Gram negativ. Primele au un perete celular gros, format dintr-un polimer numit peptidoglican, care are cea mai bună colorare ca pereții subțiri ai bacteriilor Gram-negative.
- Unele tipuri comune de bacterii Gram-pozitive sunt streptococi, stafilococi, micrococci (sau micrococci) și listeria.
- Iată câteva exemple comune de bacterii Gram-negative: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium și Campylobacter.
- Luati masurile de protectie adecvate. Bacteriile și elementele chimice pe care le veți folosi în timpul testului prezintă un risc pentru sănătatea dvs. Purtați ochelari de protecție, mănuși de nitril de unică folosință și o haină de laborator atunci când efectuați testul de colorare. După ce ați terminat, puneți mănușile și toate celelalte materiale contaminate într-o pungă specială. Nu uitați să urmați procedurile laboratorului dvs. pentru a scăpa de pungă pentru produsele contaminate.
- Puneți proba pentru a observa pe o lamelă de sticlă. Pentru a începe testul, așezați o picătură sau o probă bacteriană pe o lamelă sterilă. Apoi, glisați lama peste un arzător Bunsen aprins de trei ori pentru a fixa proba și a împiedica ieșirea de pe placă atunci când clătiți sau adăugați reactivi.
- Adăugați 5 picături de cristal violet în lamă. Turnați cinci picături dintr-o soluție violet de cristal pe probă. Așteptați un minut pentru ca proba să absoarbă violetul de cristal.
- Țineți lama pe loc cu ace de haine, astfel încât să nu vă pătați mâinile.
- Spălați lama bine pentru a îndepărta pata. Folosiți un robinet sau o sticlă de stoarcere și lăsați apa să curgă foarte lent până la cinci secunde pentru a îndepărta reziduurile de cerneală care nu s-au aderat la probă.
- Turnați cinci picături dintr-un Stain Diode Gram pe lamelă. Este o soluție formată din diodă, bicarbonat de sodiu și diodură de potasiu care determină violeta de cristal să se topească cu pereții celulari ai bacteriilor. Turnați cinci picături de soluție pe probă și lăsați-l timp de un minut.
- Spălați proba cu alcool sau acid lactic. Alcoolul și lacetona sunt agenți de albire și vor elimina colorarea pereților celulelor bacteriene dacă sunt Gram-negative. Se toarnă câteva picături de înălbitor pe probă și se lasă să acționeze nu mai mult de trei secunde. După aceea, încercați să clătiți ușor cu apă timp de cinci secunde pentru a îndepărta acești agenți de albire.
- Dacă permiteți înălbitorul să funcționeze mult timp, aceasta poate duce la dispariția de colorarea bacteriilor Gram-pozitive, ceea ce duce la un fals negativ.
- Efectuați un test de contrast cu safranină. Safranina este un colorant roșu care contrastează cu violeta de cristal, colorând astfel bacteriile neafectate de colorația purpurie. Se toarnă aproximativ cinci picături de safranină pe probă și se lasă timp de un minut. După aceea, încercați să clătiți ușor cu apă timp de cinci secunde.
- Vizualizați proba dvs. la mărirea 1000X. Bacteriile vor deveni violet sau violet dacă este Gram pozitiv sau roz dacă este Gram negativ din cauza safraninei.
Metoda 2 Efectuați testul de colorare Ziehl-Neelsen
- Utilizați această tehnică pentru a detecta bacteriile cu aciditate rapidă. Aceste specii conțin o cantitate mai mare de lipide, ceea ce le face mai rezistente la coloranții folosiți în colorația Gram. Bacteriile rezistente la acid aparțin genului Mycobacterium, care include bacteria responsabilă de tuberculoză (M. tuberculosis). Pentru vopsirea unei bacterii rezistente la acizi, trebuie să folosiți un colorant roșu numit fuchsin carbolic, rezistent la clătirea cu soluții de acid sau acid sulfuric.
- Luati masurile de protectie adecvate. Materialele chimice și biologice utilizate în timpul colorației Ziehl-Neelsen pot fi periculoase. În plus, va trebui să utilizați, de asemenea, surse de căldură, precum o duză Bunsen, un încălzitor electric sau o lampă cu alcool. Urmați instrucțiunile de mai jos pentru a efectua testul.
- Puneți ochelari de protecție, mănuși de nitril și o haină de laborator.
- Aveți grijă să nu inspirați vaporii de la vopsele și înălbitori și să nu lăsați picăturile să vă stropească ochii sau pielea. Țineți containerele deschise sub capotă.
- Fiți foarte atenți când încălziți lama. Majoritatea substanțelor chimice utilizate sunt inflamabile. De asemenea, pot exista urme de substanțe inflamabile pe lamele sau alte echipamente.
- Pregătiți lama. Cu mișcări circulare, răspândiți uniform o cantitate mică de probă bacteriană în centrul unui tobogan steril. Proba dvs. ar trebui să ocupe aproximativ 10 mm cu 20 mm.
- Uscați lama. Puneți lama pe structura de uscare cu eșantionul orientat în sus. Lăsați-l să se usuce natural timp de 30 de secunde. Nu încercați să uscați lama cu o cârpă.
- Asigurați eșantionul cu căldură. Cu eșantionul în sus, glisați lama de două sau trei ori peste un arzător Bunsen aprins. De asemenea, puteți așeza lama pe un încălzitor electric, setând temperatura între 65 ° C și 75 ° C timp de cel puțin două ore. Aveți grijă să nu fierbeți sau să ardeți proba.
- Se adaugă fuchsinul carbolic în lamă. Turnați mai multe picături din această soluție pe lamelă. Turnați suficient pentru a acoperi complet proba.
- Încălziți lama pentru a fixa colorantul. Încălziți lamela cu atenție peste un arzător Bunsen sau o lampă cu alcool, cu proba orientată în sus sau așezați-o pe un încălzitor electric. Încălziți lama la 60 ° C sau până când începe să elibereze abur. Lăsați colorantul să acționeze cinci minute.
- Dacă utilizați un încălzitor electric, porniți-l la 60 ° C. Dacă optați pentru lampa cu alcool sau arzătorul Bunsen, ar trebui să vă așteptați să vedeți fum.
- Pentru a menține lama la temperatura dorită timp de cinci minute, încălzește-l intermitent.
- Aveți grijă să nu fierbeți, să ardeți sau să nu uscați proba.
- Clătiți lama cu apă rece. Lăsați-l să se răcească cinci minute și clătiți ușor câteva secunde cu apă limpede. Folosiți apa de la robinet sau o sticlă de stoarcere pentru a îndepărta petele de colorant care nu s-au aderat la probă.
- Se toarnă pe probă alcool acid sau acid sulfuric. Folosiți un volum de 3% în volum (v / v) alcool sau 20% acid sulfuric pentru a acoperi complet eșantionul. Lăsați acidul să funcționeze până când culoarea se estompează și atinge o nuanță de roz foarte strălucitoare. Procesul durează de obicei aproximativ zece minute.
- Folosiți apă curată pentru a clăti lama. Spălați ușor lama sub un robinet sau utilizând o sticlă de stoarcere. Îndepărtați bine toate resturile de acid și colorant.
- Adăugați agentul de contrast. După ce ați clătit toboganul, turnați pe colorantul de malachit verde sau albastru de metilen. Aceste două soluții creează un fundal albăstrui sau verzui pe care va apărea colorantul roșu, precum și alte materiale biologice, cum ar fi celulele umane și bacteriile neacidice. Lăsați substanțele să acționeze timp de una până la două minute.
- Clătiți și uscați lama. Clătiți bine cu apă pentru a îndepărta excesul de contrast. După ce ați terminat, uscați spatele lamei cu o cârpă uscată și lăsați-o să se usuce natural pe un suport.
- Vizualizați proba dvs. la mărirea 1000X. Bacteriile rezistente la acid vor deveni roșii sau roz închis. Alte bacterii, celule non-bacteriene și baza lamei vor deveni verzi sau albastre.
Metoda 3 Studiați comportamentul și aspectul bacteriilor
- Analizați forma bacteriilor. După efectuarea testului de colorare pentru a determina dacă bacteriile sunt Gram-pozitive, Gram-negative sau rezistente la acid, este timpul să identificăm specia mai precis. În primul rând, analizați forma bacteriilor de pe diapozitiv. Cele mai frecvente trei forme sunt coccii (sferici), spiralele și bacilii (forma tijei).
- Există mai multe variante ale acestor forme. Bacteriile în formă rotundă (cocus), de exemplu, pot apărea în perechi (diplococi), în lanțuri, în grămezi sau în grupuri de patru (tetradi).
- Aflați dacă bacteriile sunt aerobe sau anaerobe. Ia două probe de bacterii și creează două culturi separate. Luna trebuie să fie anaerobă (crescută fără oxigen), în timp ce cealaltă trebuie să fie aerobă (crescută cu oxigen). Păstrați cultura anaerobă la 35 ° C într-un loc fără oxigen timp de cel puțin 48 de ore înainte de a observa creșterea.
- Dacă bacteriile cresc într-un mediu fără oxigen, dar nu atunci când sunt expuse la oxigen, înseamnă că sunt anaerobe.
- Deși se dezvoltă într-un mediu oxigenat, dar nu în absența oxigenului, acestea sunt aerobe.
- Când se dezvoltă în ambele medii, vorbim despre bacterii anaerobe facultative.
- Efectuați un test de motilitate. O bacterie este mobilă dacă se poate deplasa singură cu unul sau mai mulți flageli. Gradul de motilitate este foarte important în identificarea anumitor specii bacteriene. Există mai multe tipuri de motilitate, dar cel mai sigur și mai lizibil este mijlocul semi-solid.
- Creați o cultură pentru testul de motilitate. Pregătiți o cultură de bacterii într-un bulion de cultură. Urmați instrucțiunile de mai jos pentru a pregăti bulionul ales.
- Inoculați cultura într-un agar semi-solid pentru teste de motilitate. Înveliți o porțiune din cultura bulionului cu un ac de inoculare steril. Plantați cu grijă acul în tubul dagar semi-solid, cum ar fi lagarul TTC, pe care l-ați pregătit pentru test. Acul trebuie să pătrundă 2/3 din agar.
- După ce ați terminat, scoateți cu atenție acul, având grijă să nu depășiți limitele zonei de inoculare.
- Incubați tubul la 30 ° C timp de 48 de ore.
- Citiți rezultatul testului. Agarul pentru testul de motilitate va deveni roșu la contactul cu bacteriile. Dacă sunt mobile, această tentă roșie sau roz este răspândită în toată substanța. În caz contrar, colorarea va fi limitată la locul injecției.
Metoda 4 Interpretați toate rezultatele
- Adună comentariile tale. Pentru a cunoaște tipul de bacterii, va trebui să adunați informațiile obținute din culturi, testele de colorare și observarea formelor. Dacă examinați eșantioanele unui pacient, simptomele pe care le prezintă pot ajuta și la determinarea tipului de bacterii adecvate.
- De exemplu, dacă testele arată că bacteriile sunt gram-negative, anaerobe, nemotive și observați simptome precum dureri abdominale, greață și vărsături, este posibil ca pacientul să sufere de infecție cu Bacteroides. fragilis.
- Consultați o bază de date. În lume există mii de specii de bacterii. Este imposibil să știi totul pe de rost. Probabil va trebui să consultați o carte de microbiologie clinică sau o bază de date online pentru a compara rezultatele testelor cu informațiile despre speciile bacteriene.
- Există resurse online excelente pentru identificarea bacteriilor, dar majoritatea acestor baze de date sunt disponibile în limba engleză, inclusiv Patricbrc.org și GlobalRPh. Cu toate acestea, puteți găsi în continuare informații utile pe site-ul Centrului Internațional de Resurse Microbiene INRA.
- Faceți un test genetic pentru a cunoaște speciile exacte ale bacteriilor. În unele cazuri, poate fi necesar să identificați speciile de bacterii. Cea mai rapidă și ușoară metodă este efectuarea unui test ADN. Testele ADN sunt utile și pentru identificarea bacteriilor rezistente la formele tradiționale de colorare și cultură. În zilele noastre, testele ADN pe microorganisme sunt foarte rapide și pot fi gata în mai puțin de două ore.
- Dacă nu aveți acces la un laborator care efectuează secvențiere genetică a microorganismelor, trimiteți o probă bacteriană unei agenții specializate.